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成像系统（例如显微镜）的衍射极限分辨率可以通过不同方式表征。 在本文中，我建议使用在OpticStudio中计算的点扩散函数 (PSF) 来客观衡量这些成像系统的分辨率。文中介绍了重叠图像（探测器）平面上两个点的PSF的两种方法。 第一种方法使用多重结构编辑器，第二种方法使用图像模拟工具。文中比较了这两种方法，并讨论了它们的优缺点。
作者 David Nguyen , Berta Bernard, Chris Normanshire
简介
成像系统的性能与其分辨率有关，但分辨率的定义各不相同。在超分辨率显微镜中，傅里叶环相关[1]用于评估分辨率。 在衍射极限显微镜中，分辨率是用瑞利或斯派罗准则估算的[2]。在实践中，这些系统的分辨率也可以用微粒测量，微粒选择明显小于预期分辨率，选定上述标准之一。这些微粒充当形成PSF的点发源，其尺寸给出了图像分辨率的估计值，同样，该尺寸根据其定义而变化。在本文中，我们使用OpticStudio中的PSF来更客观地评估衍射极限成像系统的分辨率。
方法一：多重结构编辑器（相干成像）
显微镜设计
在整篇文章中，我使用了基于TL4X-SAP物镜（4X，0.2 NA）和TTL200管镜的显微镜设计，如图1所示。这两种透镜都可由THORLABS网站以黑盒形式提供。
图 1 - 由THORLABS的黑匣子元件组成的显微镜设计。放大倍数为4X，数值孔径 (NA) 为0.2。
我们使用“真实图像高度”定义并指定了在X和Y半宽为6.656毫米的正方形上具有相等面积的五个视场，对应于物平面中的1.664毫米。视场由像面中具有2048x2048像素和13.312x13.312mm2物理尺寸的科学 CMOS (sCMOS) 探测器进行建模。这些探测器通常用于显微镜，可以在Orca-Flash4.0 V3 (Hamamatsu) 或Zyla 4.2 plus (Andor) 等相机产品中找到。 我还使用了OpticStudio的波长 F、d、C（可见光）预设。 使用标准执行优化：具有四个环和六个臂的RMS波前质心，以及默认的空气边界约束（0 到 1000 毫米）。此外，该系统还受到远心和-4倍放大倍率的限制（在此显微镜设计中，图像是颠倒的）。
我选择这种显微镜设计是因为它相对容易设置并且具有实际应用。例如，机器视觉应用中通常需要远心性（如此处讨论）。我们始终保持优化简单，本文无意描述显微镜设计的一般情况。然而，本文的结果和结论适用于大多数具有共轭物体和像平面的成像系统，其中对衍射的大部分贡献发生在出瞳处，这意味着惠更斯点扩散函数 (PSF) 是评价系统性能的一个好参考。
多重结构设计
为了解决显微镜设计的分辨率问题，我们在物平面中创建了两个点源，并逐渐将它们分开，距离接近瑞利准则，并观察它们的PSF如何在图像平面中重叠。在显微镜设计中，瑞利准则yRayleigh可由下式计算：
其中λPrimary是主波长0.588 um，NA是物镜的数值孔径0.2（本文不讨论聚光镜 NA）。虽然瑞利准则可以作为系统分辨率的衡量标准，但它假定一个完美的圆形、无畸变孔径光阑和非相干照明（有关瑞利准则的更多详细信息可以在此处找到）。此外，瑞利标准是一种主观度量，用于确定两个PSF的可辨别性，这实际上取决于观察者，以及需要从显微镜图像中检索的信息类型，我们将在本节的其余部分中看到。
首先删除除轴上场（场1）以外的所有场，然后将其转换为象度，如图2所示。
图 2 - 用于分析显微镜分辨率的多配置方法的场设置。仅保留轴上视场，并且已将其转换为象度。
然后，使用单个YFIE操作数创建两个结构，并在第二个结构中指定值1.8e-3 mm，如图3所示。
图 3 - PSF重叠分析的多重结构设置。 两个点源在物平面上相距1.8 um。
最后，使用一个惠更斯PSF和惠更斯PSF截面来分析图像平面中两个PSF的重叠。两种分析可以对两种配置中的各个PSF进行相干求和（有关更多详细信息，请参阅帮助文件）。分析设置显示在图4中，特殊的多重结构设置显示为红色框和箭头（此选项不适用于FFT PSF）。
图 4 - 惠更斯PSF设置。通过检查菜单栏中的所有配置，对各个PSF执行相干求和。
着重分析轴上场的分辨率上，但在各个视场的每个部分都可以进行相同的分析。
惠更斯PSF的结果如图5所示。
图 5 - 惠更斯PSF的结果，以及PSF截面与多重结构中1.8 um（瑞利准则）的物平面Y场分离重叠。 在这种显微镜设计中，肉眼很难区分两个点光源。
可以看出，两个场点在图像平面上严重重叠，它们各自的 PSF 几乎无法区分。有两个原因可以解释这个结果。首先，通过执行PSF的相干求和，违反了瑞利准则的非相干照明假设，并导致分辨率下降。其次OPD 扇形图显示出0.25波量级的像差，并且该显微镜位于衍射极限的边缘，这意味着它的衍射极限足以进行诸如惠更斯PSF之类的分析，但它仍然存在一些几何像差，这改变了系统的衍射极限性能。根据经验，最大化视野和分辨率的显微镜设计往往属于近衍射极限系统的类别，并且通常难以仅基于瑞利准则进行表征。
根据瑞利准则，可以增加场的分离距离，并重新评估结果。我们已经在图 6 中完成了它，在物平面中分离了2.3 um。
图 6 - 惠更斯PSF的结果，以及PSF截面与多重结构中2.3 um的物平面Y场分离。通过增加点之间的间隔距离，PSF开始在图像平面中分离，并且可以观察到两个不同的峰值。
随着更大距离的分离，产生的PSF变得可区分。惠更斯PSF截面中的峰分离几乎10 um，这与系统放大倍数 (4X) 一致。当我们说“可区分”时，它是对我们在图 6 中看到的内容的定性评估。但是，如果定义了在后处理方面应如何分离峰，则可以使该标准更加客观。例如，一个标准可能是“我希望能够用80% 的阈值并检测两个独立的点”，在这种情况下，可以使用OpticStudio优化峰值间距以对应于最大相对辐照度的80% （这超出了本文的范围）。
最后，我们还可以考虑探测器的物理像素大小，以获得从显微镜看到的图像。 PSF的半高全宽约为12um，我们假设的探测器的物理像素大小为6.5 um，这显然违反了Nyquist-Shanon采样定理，这是显微镜设计的另一个限制。图7显示了当图像采样更改为32x32像素且图像增量（物理像素大小）为6.5 um时的惠更斯PSF结果。
图 7 - 考虑探测器的物理像素大小时，PSF重叠。 像素太少导致PSF重叠并进一步降低显微镜的分辨率。
可以看出，物理像素尺寸不足进一步降低了显微镜的分辨率，虽然在图6中可以区分两个峰值，但它们现在在图7中再次重叠。在这种情况下，显微镜分辨率被称为像素受限，并且至少是放大倍数缩放的像素大小的两倍，即3.25 um（6.5除以4的两倍）。物平面中场之间3.25 um分离距离的结果如图8所示。
图 8 - 考虑到探测器的物理像素大小时，PSF重叠。 3.25 um的分离使PSF再次分离。该距离对应于像素大小除以放大倍数的两倍，这是奈奎斯特-香农采样定理的结果。
考虑探测器像素大小，需要更大的分离以避免PSF混叠，并确保它至少由2个像素表示。3.25um的视场间隔与1.8 um瑞利标准大不相同，并且显示了分辨率的定义是多么模糊，但在本文中还没有考虑显微镜的公差，这将进一步降低该指标。
本节中介绍的方法考虑了两个相邻PSF的相干和，以及如何将它们彼此区分开来。虽然这种方法适用于相干成像系统，但对于非相干成像系统通常更为保守，并且可能导致性能过高的设计，这本身就成本更高。例如，在荧光显微镜中，分辨率是用荧光微珠测量的。从荧光微珠发出的光通常被认为是不相干的。在这种情况下，显微镜的性能有望更符合瑞利准则。
在下一节中，我将展示如何使用OpticStudio的图像模拟功能，通过非相干地对距离相近的点的PSF求和来研究非相干照明假设下显微镜设计的分辨率。
方法二：图像模拟（非相干成像）
对于这种方法，可以保留带有5个视场的原始显微镜设计，并将它们转换为象度（图 2）。在深入介绍图像模拟方法之前，我们想通知读者，本文不涉及OpticStudio的这个功能的细节，我们假设你熟悉它，并且能够正确设置它（有关图像模拟的更多详细信息，我建议读者参阅此知识库文章）。
设置图像模拟的第一步是为其提供输入图像文件。由于图像模拟本质上是用这个输入图像执行显微镜 PSF 的卷积，我希望在我的输入图像中有多个冲击函数来模拟紧密分离的视场。换句话说，我的输入图像是一个完全黑色（零值像素）的背景，在每个字段的位置有一个白色（最大值）像素。像素的大小尽可能小，同时保持图像大小不要过大，这会导致合适的计算时间（以分钟为单位）。我选择表示图5-8中显示的惠更斯PSF面积的大约四倍，即400x400um2，这构成了固有限制。该区域随放大倍数缩放以对应于100x100um2的视场大小（请记住，放大倍数为4X）。我还选择我的图像大小为1600x1600像素，因此我的像素尺寸为0.0625x0.0625um2，远低于1.8 um的瑞利标准。我在我的图像中创建了六个白色像素，它们对应于两个近场的三种情况。这三种情况与第一种方法中分析的情况大致相同：分别为 1.8 (29)、2.3 (37) 和3.25 (52) um（像素）。包含白色像素的输入图像区域的放大图如图9所示，该图像可从文章附件 (PointSources.BMP) 中获得。
图 9 - 放大输入图像，显示六个白色像素对应于由 1.8 (29)、2.3 (37) 和3.25 (52) um（像素）分隔的三对点。 横像间隔为6.25 (100) um（像素），避免了场对之间的重叠。 上方的像素位于图像中的(800, 800)。
图像模拟的源位图设置如图10所示。
图 10 - 源位图的图像模拟设置。视场高度为100 um（镜头单位为0.1 mm），输入图像以同轴视场为中心。
视场高为100 um。对于这种方法，我们还将分析重点放在轴上场上，但也可以在不同的场位置进行相同的分析，我使用当前系统编辑器中定义的波长1到3的组合。
PSF网格设置如图11所示。
图 11 - 左图：图像模拟功能的卷积网格设置。由于进行分析的区域受限，因此它在轴上使用单个PSF。采样设置的选择与惠更斯PSF方法相同。像差设置为衍射。右图：生成的PSF网格，如图像模拟功能所示。
使用与惠更斯PSF方法相同的采样设置，并在轴上使用单个PSF。这样做是因为视场高度为100um，这对应于我不希望PSF不会随着视场的一小部分改变发生太大的变化。图像模拟的结果如图12所示，默认探测器器和显示设置（全为零），计算这些结果可能需要几分钟时间。
图 13 - 考虑显微镜探测器物理尺寸时的探测器和显示设置。
考虑探测器物理特性的结果如图14所示，计算这些结果可能需要几分钟时间。
图 14 - 考虑显微镜探测器物理尺寸的图像模拟结果。 即使在物平面中3.25 um的分离也不能分离 PSF。 6.25um的横向间距使点对可区分。
紧密定位的点之间的分离不再可能，并且可以观察到，严格使用Nyquist-Shanon采样定理来确定像素限制分辨率通常是不够的。我们可能很幸运找到了图8的结果，而这些结果可能会出现混叠。在物平面中，点对之间的横向间隔为6.25 um（图 9），这使得这些场对之间的间隔干净利落。因此，我假设分辨率在3.25和6.25um之间。进一步的分析表明，5.125um的间隔可使物点的视觉、定性分离，如图15所示。
图 15 - 物平面中相距5.125um的一对点的图像模拟结果。两个较亮的像素似乎在强度上是可区分的。
再次强调，分辨率是一个随意的标准，最好从后处理需求的角度来定义它，但我希望说清楚设计的那些方面有助于分辨率，并且需要有一个明确的定义以确保对设计性能的正确评估，这也将有助于进行后续测试。再次强调，我没有讨论公差，这将进一步降低实际显微镜的性能。
参考资料
[1] N. Banterle, K. HuyBui, E. A.Lemke, and M. Beck, "Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy," J. Struct. Biol 183 (3), pp 363-367 (2013)
[2] J. S. Silfies, and S. A. Schwartz, "The Diffraction Barrier in Optical Microscopy," Retrieved from: https://www.microscopyu.com/techniques/super-resolution/the-diffraction-barrier-in-optical-microscopy on November 12, 2019.
KA-01868