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顕微鏡などの回折限界にある結像光学系の解像度は、さまざまな方法で評価できます。このブログ記事では、このような結像光学系の解像度を決める客観的尺度として、OpticStudio で計算できる点像分布関数 (PSF) を使用する方法について解説します。像面 (ディテクタ) 上の 2 つの視野点の PSF を重ね合わせる 2 つの方法を紹介します。第 1 の方法はマルチコンフィグレーション エディタ、第 2 の方法は画像シミュレーション ツールを使用します。これら 2 つの方法を比較し、それぞれの長所と短所を検討します。
著者: David Nguyen with the help of Berta Bernard, and Chris Normanshire
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はじめに
結像光学系の性能は解像度に関係しますが、解像度にはさまざまな定義があります。超解像顕微鏡の場合、解像度の評価にはフーリエ リング相関 [1] が使われます。回折限界の顕微鏡では、レイリーまたはスパローの基準に基づいて解像度を見積もります [2]。実際には、これらの光学系の解像度は、上記の基準のいずれかを仮定して、予想される解像度よりも十分に小さなマイクロビーズを使用しても測定できます。これらのマイクロビーズは、PSF を構成する複数の点光源として機能し、そのサイズから像面の解像度を見積もることができます。ただし、この場合もサイズは定義によって異なります。この記事では、OpticStudio の PSF を使用して、回折限界にある結像光学系の解像度を、より客観的に評価する方法を解説します。
方法 1: マルチコンフィグレーション エディタ (コヒーレントな結像)
顕微鏡の設計
このブログ記事の全体を通して使用する顕微鏡の設計は、図 1 に示すように TL4X-SAP 対物レンズ (4 倍、NA = 0.2) と TTL200 チューブ レンズから構成されます。両レンズは、THORLABS の Web サイトからブラックボックスとして入手できます。
図 1 - THORLABS のブラックボックス エレメントで構成される顕微鏡の設計。倍率は 4 倍、開口数 (NA) は 0.2 です。
視野点の定義には実像高を使用し、X および Y 半幅が 6.656 mm の領域内に面積が等しくなるように 5 つの視野点を指定します。この X および Y 半幅は対物面の 1.664 mm に相当します。この視野点の定義は、像面に配置された 2048 x 2048 ピクセル、物理サイズ 13.312 x 13.312 mm2 のサイエンティフィック CMOS (sCMOS) ディテクタをモデル化しています。顕微鏡に広く使用されているディテクタで、Orca-Flash4.0 V3 (浜松ホトニクス) や Zyla 4.2 plus (Andor) カメラなどの製品に搭載されています。OpticStudio に事前設定されている F, d, C (可視) 波長も使用します。最適化は、次の基準に基づいて実行します。4 つのリング、6 つのアーム、デフォルトの空気の境界制約 (0 ～ 1000 mm) による RMS 波面セントロイド。さらに、テレセントリック光学系であること、倍率が -4 倍 (この顕微鏡設計では像が反転します) であることも制約に加えています。
こうした設計の顕微鏡を選んだのは、設定が比較的簡単であり、かつ実際の用途が存在するためです。たとえば、マシン ビジョンなどの用途では、しばしばテレセントリックな光学系が必要になります (詳細は、こちら)。このブログ記事は、最適化を単純なものに留めており、顕微鏡の一般的な設計方法を紹介することを目的としていません。しかし、解析結果や結論は共役の物平面と像平面を持つほとんどの結像光学系に当てはまります。そのような光学系の回折に最も寄与するのは射出瞳であり、これは、光学系の性能を表すのにホイヘンス点像分布関数 (PSF) が適していることを意味します。
マルチコンフィグレーションの設定
顕微鏡設計の解像度を扱うために、物体面に 2 つの点光源を作成します。両者の間隔をレイリー基準に近い値に徐々に近づけ、像面でそれらの PSF がどのように重なり合うかを観測します。顕微鏡設計におけるレイリー基準 yRayleigh は次式で計算されます。
ここで λPrimary は主波長の 0.588 um、NA は対物レンズの開口数 0.2 です (この記事ではコンデンサの NA は無視します)。レイリー基準は光学系の解像度の指標として使用できるものの、完全な円形で収差のない開口絞りと、インコヒーレントな照明を前提としています (レイリー基準に関する詳細は、こちらを参照してください)。さらに、レイリー基準は 2 つの PSF を区別できるかどうかを決定するという主観的な指標であり、この後、説明するように、観測者および顕微鏡の像から取得する必要がある情報の種類に依存します。
はじめに、軸上視野 (視野 1) 以外の視野点をすべて削除します。そのうえで、図 2 に示すように視野 1 を [物体高] (Object Height) に変換します。
図 2 -マルチコンフィグレーション法による顕微鏡の解像度解析における視野の設定。軸上視野のみを残し、これが物体高に変換されています。
次に、1 つの YFIE オペランドを含むコンフィグレーションを 2 つ作成し、第 2 のコンフィグレーションに値 1.8e-3 mm を指定します (図 3 参照)。
図 3 - PSF の重なり解析のためのマルチコンフィグレーションの設定。2 つの点光源は物体面で 1.8 um 離れて配置されます。
最後に、像面の 2 つの PSF の重なりを ホイヘンス PSF とホイヘンス PSF 断面 を使用して解析します。これら 2 つの解析を使用すると、2 つのコンフィグレーション間で、個々の PSF のコヒーレントな加算を実行できます (詳細は、ヘルプ ファイルを参照してください)。解析の設定を図 4 に示します。赤枠で囲まれた、赤の矢印の部分はマルチコンフィグレーションの固有設定です (このオプションは FFT PSF では使用できません)。
図 4 - ホイヘンス PSF の設定。メニュー バーで、すべてのコンフィグレーション ([すべて] (All)) を選択すると、個々の PSF のコヒーレントな加算が実行されます。
ここでは、軸上視野のみに注目しますが、同じ解析は視野のあらゆる部分に適用できます。
ホイヘンス PSF の結果を図 5 に示します。
図 5 - マルチコンフィグレーションにより物体面で Y 視野を 1.8 um 離した設定 (レイリー基準) で解析したホイヘンス PSF および PSF 断面の重なり解析の結果。この顕微鏡設計では、これら 2 つの点光源を肉眼で区別することはほとんど不可能です。
結果を見てわかるとおり、2 つの視野点の像面での重なりは著しく、それぞれに対応する PSF をほとんど区別できません。こうした結果が得られた理由は 2 つ考えられます。第 1 に、PSF のコヒーレントな加算を実行しているため、レイリー基準のインコヒーレントな照明という前提に違反しています。そのために解像度が劣化しています。第 2 に、OPD 収差図は 0.25 波長ほどの収差を示しており、この顕微鏡は回折限界の端に位置しています。つまり、ホイヘンス PSF などの解析を適用するには十分な回折限界であるものの、ある程度の幾何光学的収差は残っており、これが光学系の回折限界性能を変化させているということです。筆者の経験によれば、視野と解像度の両方を最大化する顕微鏡の設計は、このような近回折限界に近いの光学系に分類される場合が多く、これがしばしばレイリー基準だけで特性を評価することを困難にします。
レイリー基準から視野点の間隔を拡げて、結果を再評価できます。図 6 が、その結果で、物体面で間隔を 2.3 um まで増やしています。
図 6 - マルチコンフィグレーションにより物体面で Y 視野を 2.3 um 離した設定で解析したホイヘンス PSF および PSF 断面の重なり解析の結果。視野点の間隔を拡げたことで、像面での PSF が分離しはじめ、2 つのピークを見分けられるようになっています。
視野点の間隔を拡げると、得られる PSF のピークが区別できるようになります。ホイヘンス PSF 断面のピークの間隔はほぼ 10 um であり、これは光学系の倍率 (4 倍) に一致しています。ここで「区別できる」というのは、図 6 の定性的な評価です。しかし、この基準も、後処理で判定することを考えてピークがどの程度離れていればよいのかを定義すれば、より客観的な指標に変えることができます。たとえば、「80% の閾値を適用し、そこで 2 つの点が分離していること」という基準が考えられます。この基準を使用するなら、OpticStudio を使用してピーク間距離が最大相対照度の 80% に相当するように最適化を行えます (その詳細は、本稿では取り上げません)。
最後に、顕微鏡で見える像を得るためのディテクタの物理的なピクセル サイズを考慮することも可能です。PSF は半値全幅が約 12 um であるのに対し、今回使用している仮想的なディテクタの物理ピクセル サイズは 6.5 um であるため、明らかにナイキスト - シャノンのサンプリング理論に違反しています。これも、顕微鏡設計のもう一つの制約になります。図 7 に、像のサンプリングを 32 x 32 ピクセルに変更し、像のデルタ (物理的なピクセル サイズ) を 6.5 um とした場合のホイヘンス PSF の結果を示します。
図 7 - ディテクタのピクセルの物理的サイズを考慮した場合の PSF の重なり。ピクセル数の不足は PSF の重なりを招き、顕微鏡の解像度をさらに劣化させます。
この結果からわかるように、物理的なピクセル サイズが不適切な場合、解像度はさらに劣化し、図 6 で区別できていた 2 つのピークが、図 7 では再び重なっています。このような状況は、顕微鏡の解像度がピクセル限界にあると言われ、その値はピクセル サイズを 2 倍して倍率でスケーリングした値、つまり 3.25 um になります (2 × 6.5 ÷ 4)物体面上の視野点の間隔を 3.25 um にした場合の結果を図 8 に示します。
図 8 - ディテクタのピクセルの物理的サイズを考慮した場合の PSF の重なり。間隔を 3.25 um にしたことで、近接する視野点は再び分離可能になります。この距離は、ピクセル サイズを 2 倍して倍率で割った値に相当し、これはナイキスト - シャノンのサンプリング理論の結果です。
ディテクタのピクセル サイズを考慮すると、PSF のエイリアシングを避けるために、間隔を拡げる必要が生じ、それが 2 ピクセル以上であることが確認されます。3.25 um という視野点の間隔はレイリー基準の 1.8 um とは大きく異なります。これは、解像度の定義がいかに曖昧になりうるかを示しています。さらに、このブログ記事では考慮していない顕微鏡の公差も、この指標をさらに劣化させる可能性があります。
このセクションで紹介した方法は 2 つの近接する PSF のコヒーレントな加算を実行し、それらがどの程度区別できるのかを評価しました。この方法は、コヒーレントな結像光学系には適していますが、インコヒーレントな結像光学系に対しては通常は控えめな値が得られるため、過剰性能の設計につながり、本質的なコスト増をもたらす可能性があります。たとえば、蛍光顕微鏡の場合、解像度は蛍光マイクロビーズを使用して測定します。蛍光マイクロビーズから放射される光は、多くの場合、インコヒーレントと見なされます。その場合、顕微鏡の性能はレイリー基準の前提により沿ったものになると予想されます。
次のセクションでは、OpticStudio の画像シミュレーション機能の使い方を紹介します。このツールにより、インコヒーレントな照明という前提の下で顕微鏡設計の解像度を調べます。それには、近接する視野点からの PSF をインコヒーレントに加算します。
方法 2: 画像シミュレーション (インコヒーレントな結像)
この方法では、5 つの視野点を設定した元の顕微鏡設計をそのまま使用でき、これらの視野点を [物体高] (Object Height) に変換します (図 2)。画像シミュレーション法について詳述する前に、本稿では OpticStudio のこの機能についての詳細は触れず、読者はその使い方に習熟していて適切に設定できるものと想定していることをお伝えしておきます (画像シミュレーションの詳細については、こちらのナレッジベース記事を参照してください)。
画像シミュレーションの設定における最初のステップは、入力する画像ファイルを指定することです。画像シミュレーションの本質は、この入力画像と顕微鏡の PSF とのコンボリューションを計算することであるため、近接した視野点をモデル化する入力画像としてクロネッカーのデルタが必要になります。言い換えれば、背景が完全な黒色 (値が 0 のピクセル) で、各視野点位置に白色のピクセル (値が最大のピクセル) を配置した入力画像が必要になるということです。ピクセルのサイズは可能なかぎり小さくしますが、全体の画像サイズが、許容される時間内に (数分のオーダー) 計算が終了するような値を選びます。図 5 ～ 8 に示したホイヘンス PSF の面積の約 4 倍、つまり 400 x 400 um2 に対応する画像を選定したので、本質的なガード バンドが確保されます。この領域は倍率によってスケーリングされるので、100 x 100 um2 の視野サイズに対応付けられます (倍率が 4 倍であることを思い出してください)。1600 x 1600 ピクセルの画像を選定したので、ピクセルの寸法は 0.0625 x 0.0625 um2 となり、これはレイリー基準の 1.8 um よりも十分小さな値です。画像内には、2 つの近接する視野の 3 つのケースに対応する、6 つの白色ピクセルを作成します。3 つのケースの視野点の間隔は、第 1 の方法で検討したものと、ほぼ同じで、1.8 (29)、2.3 (37)、3.25 (52) um (ピクセル) です。入力画像の白色ピクセルを含む領域の拡大図を 図 9 に示します。この画像は、記事の添付ファイルとして提供しています (PointSources.BMP)。
図 9 - 入力画像の 6 つの白色ピクセルの拡大図。ピクセルは 1.8 (29)、2.3 (37)、3.25 (52) um (ピクセル) 隔てられた 3 つの視野点のペアに対応しています。垂直方向の間隔は 6.25 (100) um (ピクセル) で、視野のペア同士が重ならないようにしています。中央、上のピクセルは、画像内の座標 (800, 800) に配置されています。
画像シミュレーションの光源ビットマップの設定を図 10 に示します。
図 10 - 画像シミュレーションの光源ビットマップの設定。[視野の高さ] (Field Height) は 100 um (レンズ ユニットの mm 単位ならば 0.1) で、入力画像は軸上フィールドを基準にセンタリングします。
視野の高さは 100 um です。この方法でも解析は軸上視野に注目していますが、異なる視野点にも同じ解析を適用できます。また、現在システム エクスプローラに定義されている波長 1 ～ 3 の組み合わせを使用しています。
PSF のグリッド設定を図 11 に示します。
図 11 - 左 : 画像シミュレーション機能のコンボリューション グリッドの設定。解析を実行する視野が限定されていることから、軸上の PSF を 1 つだけ使用します。サンプリングの設定には、ホイヘンス PSF 法と同じ値を選択します。収差は、回折に設定します。右 : 画像シミュレーションの結果として表示される PSF グリッド。
ホイヘンス PSF 法と同じサンプリング設定と、軸上の 1 つの PSF を使用します。このような設定を選んだのは、視野の高さが 100 um であり、これは全視野の数分の一に相当する範囲であるため、視野内で PSF はそれほど変化しないと予想したからです。図 12 に、ディテクタと表示の設定をデフォルト (すべてゼロ) にした場合の画像シミュレーションの結果を示します。この計算には数分かかる場合があります。
図 12 - ディテクタと表示のデフォルト設定 (すべてゼロ) による画像シミュレーションの結果。上は両方の PSF を通る中心線上の強度プロファイル、下は視野点の間隔が (A) 3.25、(B) 2.3、(C) 1.8 um の場合の画像シミュレーションの出力です。像は、顕微鏡の光学特性 (負の倍率) により反転しています。
図 12 (C) から、レイリー基準である 1.8 um の間隔で、2 つの PSF を区別できることがわかります。強度には約 15% の小さな凹みがあり、これをたとえば閾値によって画像を後処理するときに使用できます。視野点の間隔が広いほど、分離は良くなっています。コンフィグレーション間で PSF のコヒーレントな加算を行うホイヘンス PSF 法と比較した場合、PSF の分解能という観点からは、より良好な結果が得られています。しかし、この結果では、まだディテクタの物理的サイズが考慮されていません。画像シミュレーションの設定を図 13 のように調整すればディテクタの特性を考慮できます。
図 13 - 顕微鏡のディテクタの物理的サイズを考慮する場合のディテクタと表示の設定。ディテクタの物理特性を考慮した場合の結果を図 14 に示します。これらの結果を得るための計算には数分かかる場合があります。
図 14 - 顕微鏡のディテクタの物理的サイズを考慮した場合の画像シミュレーションの結果。物体面の 3.25 um の視野点間隔でさえ、PSF を分離できません。垂直方向の間隔は 6.25 um であるため視野のペア同士は区別できます。
近接する視野点間の分離はもはや不可能であり、ピクセル限界による解像度の判断にナイキスト - シャノンのサンプリング理論を厳密に適用するだけでは不十分である場合が多いことがわかります。図 8 のような結果が得られたのは、おそらく幸運であり、エイリアシングの影響を受けて、これより特性が劣化していた可能性もあります。物体面における視野点のペア間の垂直方向の間隔は 6.25 um であり (図 9)、これらのペアは明確に分離できます。したがって、解像度は 3.25 um ～ 6.25 um の範囲にあると仮定できます。さらに視野点の間隔 5.125 um について調べると、図 15 に示すように点光源を視覚的、定性的に区別できます。
図 15 - 物体面で 5.125 um 隔てられた視野点のペアに対する画像シミュレーションの結果。2 つの明るいピクセルは、定性的には区別できるように見えます。
この場合も、基準は曖昧であり、後処理での判定に必要となる条件として客観的な基準を定義した方がいいでしょう。しかし、今回の検討で、設計のさまざまな側面が解像度に寄与することが明らかになったと言えるでしょう。設計の性能を適切に評価するには、この方式について明確な定義が必要です。そうした定義は、その後のテストの工程にも役立ちます。ここで、再度強調しておきたいのは、公差を考慮しなかったということです。公差によって実際の顕微鏡の性能はさらに劣化します。
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References
[1] N. Banterle, K. HuyBui, E. A.Lemke, and M. Beck, "Fourier ring correlation as a resolution criterion for super-resolution microscopy," J. Struct. Biol 183 (3), pp 363-367 (2013)
[2] J. S. Silfies, and S. A. Schwartz, "The Diffraction Barrier in Optical Microscopy," Retrieved from: https://www.microscopyu.com/techniques/super-resolution/the-diffraction-barrier-in-optical-microscopy on November 12, 2019.
KA-01868